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技术常见问题

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技术常见问题

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  1. 无Ct值出现

  ? 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

  ? 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。

  ? 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

  ? 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

  2. Ct值出现过晚(Ct>38)

  ? 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。

  ? PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

  ? PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

  3. 标准曲线线性关系不佳

  ? 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

  ? 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。

  ? 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针

  模板中存在抑制物,或模板浓度过高

  4. 负对照有信号

  ? 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

  ? 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。

  ? 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。

  ? 模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

  5. 溶解曲线不止一个主峰

  ? 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

  ? 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。

  ? 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。

  ? 模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

  6. 扩增效率低

  ? 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

  ? 反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

  ? 反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

  7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线,如何判断?

  判断标准:扩增效率,灵敏度,特异性

  如果扩增效率在90%-110%,都是特异性扩增,都可以把数据用于分析。

  8. 扩增曲线的异常?比如“S”型曲线?

  ? 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时,选NONE)

  ? 模板的浓度太高或者降解

  ? 荧光染料的降解

  参考资料

  1. 百泰克、Qiagen、ABI荧光定量PCR技术讲座和生物通、丁香园、螺旋网相关资料。

  2. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method Thomas D Schmittgen and Kenneth J Livak 2008, Nature Protocols: Vol3:1101-1108

  3. Real-time PCR for mRNA Quantitation Marisa L. Wong and Juan F. Medrano 2005, BioTechniques, Vol39:1-11

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